Untuk mengembang-biakkan mikroorganisme seperti kapang, khamir, jamur ataupun yang lainya diperlukan medium. Medium merupakan suatu media untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. untuk menumbuhkan mikroorganisme yang kita inginkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan.
Berdasarkan konsistensi ataupun kepadatannya, medium terbagi tiga bagian, yaitu :
1. Medium cair/broth/liquid yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
2. Medium setengah padat (semi solid medium) yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
3. Medium padat (solid medium) yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat..
Contoh : endo agar, PDA, Nutrient agar
Berdasarkan komposisi medium dapat di bagi tiga bagian, yaitu :
1. Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
2. Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
3. Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
Berdasarkan fungsinya, medium terbagi menjadi empat bagian, yaitu :
1. Medium umum, yaitu medium yang dapat ditumbuhi berbagai jenis mikroorganisme. Contoh : NA (nutrient agar) umum untuk bakteri, PDA (potato dextrose agar) dan toge umum untuk jamur.
2. Medium selektif, yaitu medium yang hanya ditunbuhi jenis mikroba tertentu. Contoh : medium SSA untuk bakteri Salmonella dan Shigella.
3. Medium diferensial, yaitu medium yang hanya ditumbuhi berbagai jenis mikroba, salah satu jenis memberikan cirri yang khas sehingga dapat segera diketahui berbeda dari yang lain. Contoh : Blood Agar, EMB agar, dll.
4. Medium pengaya, yaitu medium yang kaya akan nutrient tertentu sehingga dapat menumbuhkan dan memperbanyak sel dengan cepat. Contoh: medium Tetrathionat Broth, dll.
Medium untuk menumbuhkan mikroorganisme ada berbagai macam. Mikroorganisme dapat tumbuh sesuai dengan medium yang digunakan. Berikut adalah berbagai medium yang sering digunakan :
Nutrien Agar(NA)
Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Pada pembuatan medium NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung banyak N2 (Dwidjoseputro, 1994). Agar yang digunakan dalam proses ini untuk mengentalkan medium sama halnya dengan yang digunakan pada medium PDA yang juga berperan sebagai media tumbuh yang ideal bagi mikroba (Schlegel, 1993). Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan.
Dalam percobaan warna NA sebelum dilarutkan dalam aquades adalah coklat, dan setelah dilarutkan dalam aquades berubah menjadi kekuning-kuningan dan terdapat endapan. Jadi untuk menghilangkan endapan tersebut maka dipanaskan dalam penangas air dengan tabung Erlenmeyer disumbat dengan alat penyumbat. Setelah sterilisasi warna medium menjadi agak coklat
Potato Dextrose Agar (PDA)
PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang. Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 g media dalam 1 liter air yang telah didestilasi. Tetapi pada praktikum kali ini PDA dilarutkan pada 50mL air dengan perhitungan :
39x50 = 1000x
x = 
x = 1,95gr
jadi PDA yang digunakan untuk 50 ml aquades adalah 1,95gr.
Serbuk PDA berwarna kuning karena merupakan ekstrak kentang yang pada dasarnya berarna kuning. serbuk dicampur dan dipanaskan serta aduk. Didihkan selama 1 menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. setelah disterilisasi dalam autoklaf medium berwarna kecoklatan dan didapat endapan berwarna putih. Dinginkan hingga suhu 40-45°C dan tuang dalam cawan petri dengan pH akhir 5,6+0,2.).Setelah didinginkan, medium dapat ditanami bakteri (Schegel, 1993)
Plate Count Agar (PCA)
PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121°C). Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks.
Selain medium di atas masih terdapat medium lain yang juga memiliki fungsi untuk menumbuhkan kultur mikroorganisme, yaitu :
Lactose Broth
Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.
Nutrient Broth (NB)
Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut.
1. Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades.
2. Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama.
3. Atur pH sampai 7,0.
3. Atur pH sampai 7,0.
4. Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml.
5. Sterilisasi dengan autoklaf.
EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)
Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan metilin bklue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri koli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat), tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air.
MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar)
MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, dan Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung polysorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar tidak sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung:
1. Protein dari kasein 10 g/L
2. Ekstrak daging 8,0 g/L
3. Ekstrak ragi 4,0 g/L
4. D (+) glukosa 20 g/L
5. Magnesium sulfat 0,2 g/L
6. Agar-agar 14 g/L
7. dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L
8. Tween 80 1,0 g/L
9. Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L
10. Natrium asetat 5 g/L
11. Mangan sulfat 0,04 g/L
MRSB merupakan media yang serupa dengan MRSA yang berbentuk cair/broth.
Trypticase Soy Broth (TSB)
TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum, untuk isolasi, dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri patogen. Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik. Dikalium fosfat ditambahkan sebagai buffer untuk mempertahankan pH.
APDA
Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1 jam/45 menit, agar dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam agar lalu ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat.
Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1 jam/45 menit, agar dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam agar lalu ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat.
VRBA (Violet Red Bile Agar)
VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet kristal yang bersifat basa, sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati. Dengan VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton, NaCl, empedu, glukosa, neutral red, kristal violet, agar). Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dengan 1 liter air yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih sampai larut sempurna. Dinginkan hingga 50-60°C. Pindahkan dalam tabung sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4. Campuran garam bile dan kristal violet menghambat bakteri gram positif. Yeast ekstrak menyediakan vitamin B-kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri. Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Neutral red sebagai indikator pH. Agar merupakan agen pemadat.
PGYA
Media ini berfungsi untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir. Dengan adanya dekstrosa yang terkandung dalam media ini, PGYA dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroba terutama sel khamir. Untuk membuatnya, semua bahan dicampur dengan ditambah CaCO3 terlebih dahulu sebanyak 0,5 g lalu dilarutkan dengan akuades. Kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer dan disumbat dengan kapas lalu disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit.
STERILISASI MEDIUM DAN KEMASAN
Agar biakan bakteri dapat dibuat, maka medium dan alat-alat yang diperlukan harus disterilisasi sebelum inokulasi. Sterilisasi yaitu suatu proses untuk mematikan semua organisme yang dapat menjadi kontaminan.
Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:
1. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170o – 180oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).
2. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).
3. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba) (Suriawiria, 2005).
Metode yang lazim digunakan untuk mensterilisasikan media dan alat-alat ialah dengan pemanasan. Jika panas digunakan bersama-sama dengan uap air disebut sterilisasi basah (menggunakan autaklaf), sedangkan jika tanpa uap air disebut sterilisasi kering (menggunakan oven).
Pengenalan Autoclave
Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat-alat maupun medium mikroorganisme.Gambar di bawah adalah contoh jenis autoclave yang paling sederhana. Prinsip kerja alat ini sama dengan prinsip kerja kukusan (alat sederhana untuk menanak nasi) hanya saja memiliki tekanan sehingga menghasilkan panas yang lebih tinggi. Hal ini bertujuan untuk lebih menyempurnakan proses sterilisasi. Tahap sterilisasi sebenarnya cukup singkat yaitu dengan suhu 121 derajat celsius selama 15 menit. Namun waktu keseluruhan mulai dari pemanasan awal (kenaikan suhu) sampai pendinginan (penurunan suhu) bisa mencapai kurang lebih 2 jam-an. Yang perlu diperhatikan selama mengoperasikan alat ini adalah tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0. Medium yang mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994). Dan jangan lupa tulis siapa pengguna (nama, waktu dan lab.) sebelum start, selalu memakai sarung tangan tahan panas, isilah air sesuai ukuran yang ditentukan sebelum start, jangan membuka autoclave sebelum suhu dingin (dibawah 60 derajat celcius).
KESIMPULAN
· Medium merupakan suatu media untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba.
· Untuk mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan.
· Medium berdasarkan bentuk terbagi tiga bagian, yaitu: medium cair, semi cair, dan padat
· Berdasarkan komposisinya medium juga terbagi tiga bagian, yaitu : medium alami, medium semisintetk, dan medium sintetik
· Medium berdasarkan fungsinya terbagi empat, yaitu : medium umum, medium selektif, medium diferensial, medium pengaya.
· Sebelum membiakkan mikroorganisme, terlebih dahulu alat dan medium disterilisasi supaya tidak terjadi kontaminasi bahan lain.
· Sterilisasi yang umum dilakukan dalam laboratorium mikrobiologi adalah dengan cara pemanasan, yaitu dengan penggunaan oven dan autoclave.
· Oven merupakan alat sterilisasi kering sedangkan autoclave merupakan alat sterilisasi basah dengan prinsip yang sama dengan pengukusan tetapi menggunakan tekanan uap.
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.
enidchemicals.com
LAMPIRAN JAWABAN DAN PERTANYAAN
1. Setelah saudara pelajari dan dipraktekkan, jelaskan fungsi penambahan beef extract pada pembuatan media NA dan fungsi penambahan kentang pada pembuatan media PDA! Mengapa berbeda?
Jawab : Fungsi penambahan beef extract pada pembuatan media NA adalah untuk menumbuhkan bakteri
panambahan kentang berfungsi sebagai sebagai sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri.
Berbeda karena NA lebih dominan untuk pertumbuhan Bakteri sedangkan PDA untuk pertumbuhan kapang dan khamir.
2. Jelaskan fungsi dari larutan pengencer? Mengapa harus menggunakan KH2PO4? Dapatkah digantikan dengan senyawa kimia lain?
Jawab : Fungsi dari larutan pengencer adalah untuk mengencerkan contoh pada analisis mikrobiologi. Pengenceran dilakukan untuk memperoleh contoh dengan jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml. Larutan pengencer harus menggunakan KH2PO4 karena kalium dan fosfatnya berguna untuk memberi nutrisi sel mikroorganisme. Larutan pengencer dapat diganti dengan air sadah air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada medium yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat.
BAB III
ALAT DAN BAHAN
3.1 Pembuatan Medium
· PCA (Plate Count Agar)
· PDA (Potato Dextrose Agar)
· NA (Nutrient Agar)
· Aquades
· Spatula
· Timbangan analitik
· Erlenmeyer
· Kapas
· Batang pengaduk
3.2 Sterilisasi Peralatan dan Kemasan
· Oven
· Kompor
· Panic
· Botol
· Kain saring
· Tabung reaksi
· Cawan petri
· Erlenmeyer
· Gelas ukur
· Lap
· Detergen
· Autoclave
Tidak ada komentar:
Posting Komentar