Pada praktikum kali ini kita melakukan isolasi bakteri dan kapang dari bahan pangan. Sampel yang akan diamati adalah rendang yang dilakukan oleh kelompok 5 dan 9, kari ayam oleh kelompok 6, sayur lodeh oleh kelompok 7, sayur daun singkong oleh kelompok 8. Masing-masing sampel diambil sebanyak 1 gram lalu dilakukan pengenceran dengan menggunakan larutan aquades steril. Pengenceran hanya dilakukan sampai 10^-3 karena suatu produk makanan dikatakan masih layak konsumsi jika mikroorganisme yang terdapat di dalam makanan tersebut maksimal 10^-3/ml. Setiap melakukan pengenceran harus menggunakan pipet volume yang berbeda dan dilakukan dekat dengan api Bunsen.

Isolasi Bakteri

Bakteri tergolong sel prokariot, merupakan mikroba uniseluler, tersebar luas di alam. Hidupnya ada yang bebas, saprofit, parasit, dan sebagian pathogen pada manusia, hewan, dan tanaman. Bakteri mempunyai ukuran yang sangat kecil sehingga hanya dapat dilihat dengan mikroskop. Ukuran bakteri berkisar antara 0,5 – 2,5  (mikron) dan panjangnya 2 – 10 . Bakteri terdiri dari 3 bentuk dasar yaitu bulat atau kokus, batang atau basilus, spiral atau vibrio.

Isolasi bakteri yang diambil adalah pengenceran 10^-2 dan 10^-3. Adapun metode yang digunakan adalah metode tuang yaitu sampel yang sudah diencerkan diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet volume lalu dituang ke dalam cawan petri setelah itu medium NA dituang ke dalam cawan petri secukupnya. Cawan petri yang berisi medium dan sampel digerak-gerakkan membentuk angka 8, supaya medium dan sampel tercampur secara teratur. lalu tunggu sampai membeku. Setelah membeku jangan lupa untuk kembali membungkus cawan petri dengan kertas lalu inkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu 30⁰-32⁰C selama 2 hari. Setelah diinkubasikan lakukan perhitungan SPC dan pengamatan bentuk bakteri dengan pewarnaan gram.

Tabel pengamatan

Sampel	Pengenceran 10-2	Pengenceran 10-3	Bentuk	Gram
Sayur Singkong	333 koloni	247 koloni	Cocus	(-)
Sop	7 koloni	1 koloni	Baccil	(-)
Kari ayam	1 koloni	-	-	Tidak ada
Rendang(5)	23 koloni	18 koloni	Baccil	(+)
Rendang(9)	7 koloni	6 koloni	Baccil	(+)

Sayur singkong

Setelah diinkubasikan selama 2 hari, ditemukan pertumbuhan koloni mikroorganisme pada medium. Sehingga dapat dihitung jumlahnya :

Ini menandakan bahwa dalam pengolahannya makanan tersebut kurang dijaga kebersihannya sehingga menyebabkan jumlah mikroorganisme yang berlipat ganda. Jadi berdasarkan literature keamanan pangan, makanan tersebut sudah tidak layak konsumsi.

Setelah dilakukan pewarnaan gram didapat hasil berupa bentuk bakteri cocus/bulat dan mempunyai gram positif.

Sop

Setelah diinkubasikan selama 2 hari, ditemukan pertumbuhan koloni mikroorganisme pada medium kurang dari 30 cawan petri, berarti pengenceran yang dilakukan terlalu tinggi. Oleh karena itu, jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung(Fardiaz, S. 1992). Sehingga dapat dihitung jumlahnya :

Sesuai dengan ketentuan yang menyatakan bahwa suatu bahan pangan mempunyai kelayakan konsumsi jika jumlah mikroorganisme yang terkandung dalam suatu pangan adalah 10^-3/ml, maka makanan sop ini masih layak konsumsi.

            Setelah dilakukan pewarnaan gram, dapat diketahui bahwa mikroorganisme yang tumbuh pada makanan tersebut berbentuk baccil/batang dan merupakan gram negative.

Kari ayam

Sama halnya seperti sop, pada kari ayam pertumbuhan koloni yang ditemukan pada medium kurang dari 30 sehingga berlaku sistem perhitungan seperti di atas.

Jadi makanan ini masih layak konsumsi.

Rendang

            Pengamatan terhadap rendang dilakukan oleh 2 kelompok, masing-masing menunjukkan hasil yang berbeda.

Perhitungan mikroorganisme oleh kelompok 5 :

Perhitungan oleh kelompok 9 :

Dari hasil perhitungan mikroorganisme yang kita dapat, rendang yang diamati oleh kelompok 5 sudah tidak layak konsumsi,  sedangkan rendang yang diamati oleh kelompok 9 masih layak konsumsi.  Setelah dilakukan pewarnaan gram oleh masing-masing kelompok didapat hasil yang sama dimana bakteri yang didapat berbentuk baccil/batang dan mempunyai gram positif.

Semua bakteri yang tumbuh pada makanan bersifat heterotropik, yaitu membutuhkan zat organik untuk pertumbuhannya. Dalam metabolismenya, bakteri heterotropik menggunakan protein, karbohidrat, lemak, dan komponen makanan lainnya sebagai sumber karbon dan energi untuk pertumbuhannya.

(Sumber : http://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri)

Kandungan air dalam bahan makanan memengaruhi daya tahan bahan makanan terhadap serangan mikroba. Kandungan air tersebut dinyatakan dengan istilah a_w (water activity), yaitu jumlah air bebas yang dapat digunakan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Setiap mikroorganisme mempunyai a_w, minimum agar dapat tumbuh dengan baik, misalnya bakteri pada aw 0,90, khamir a_w 0,80-0,90, serta kapang pada a_w 0,60-0,70. Air bebas adalah air yang secara fisik terikat dalam jaringan matriks bahan pangan seperti membran kapiler, serat, dan lain-lain.

Berikut merupakan beberapa contoh bakteri yang banyak menginfeksi makanan sehari-hari :

1. Escherichia coli

E. coli merupakan mikroflora alami yang terdapat pada saluran pencernaan manusia dan hewan. Beberapa galur E. coli yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia adalah enterotoksigenik, enterohaemorrhagik, enteropatogenik, enteroinuasiue, dan enteroagregatif. Enterotoksigenik E. coli merupakan penyebab diare pada wisatawan yang mengunjungi negara yang standar higienitas makanan dan air minum berbeda dari negara asalnya. Enterohaemorrhagic E. coli 0157:H7 akhir-akhir ini diketahui merupakan bakteri patogen penyebab foodborne diseases. Kontaminasi enterohaemorrhagic E. Coli 0157:H7 yang banyak ditemukan pada sayuran dapat terjadi akibat penggunaan kotoran sapi sebagai pupuk.

2. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus terdapat pada rongga hidung, kulit, tenggorokan, dan saluran pencernaan manusia dan hewan. Bahan makanan yang disiapkan menggunakan tangan, seperti penyiapan sayuran mentah untuk salad, berpotensi terkontaminasi S. aureus. Jenis makanan lain yang sering terkontaminasi oleh S. aureus adalah daging dan produk daging, ayam, telur, salad (telur, tuna, ayam, kentang, dan makaroni), produk bakeri, pastry, pai, sandwich, serta susu dan produk susu. Keracunan oleh S. aureus diakibatkan oleh enterotoksin yang tahan panas yang dihasilkan oleh bakteri tersebut.

3. Salmonella

Salmonella bersifat patogen pada manusia dan hewan lainnya, dan dapat menyebabkan demam enterik dan gastroentritis. Diketahui terdapat 200 jenis dari 2.300 serotip Salmonella yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia.

4. Shigella

Shigella merupakan bakteri patogen di usus manusia dan primata penyebab shigella (disentri basher). Makanan yang sering terkontaminasi Shigella adalah salad, sayuran segar (mentah), susu dan produk susu, serta air yang terkontaminasi. Sayuran segar yang tumbuh pada tanah terpolusi dapat menjadi faktor penyebab penyakit, seperti disentri basher atau shigellosis yang disebabkan oleh Shigella. Menurut USFDA (1999), diperkirakan 300.000 kasus shigellosis terjadi di Amerika Serikat setiap tahun.

5. Vibrio cholera

Sebagian besar genus Vibrio ditemukan di perairan air tawar atau air laut, serta merupakan bakteri patogen dalam budi daya ikan dan udang. Spesies Vibrio yang termasuk patogen adalah V. cholerae, V. parahaemolyticus, dan V. vulvinicus. Spesies V. chloreae dan V. parahaemolyticus merupakan sumber kontaminasi silang antara buah dan sayuran mentah, sedangkan V. vulvinicus penyebab infeksi pada manusia.

6. Clostridium botulinum

Clostiridium botulinum merupakan bahaya utama pada makanan kaleng karena dapat menyebabkan keracunan botulinin. Tanda-tanda keracunan botulinin antara lain tenggorokan kaku, mata berkunang-kunang, dan kejang-kejang yang menyebabkan kematian karena sukar bernapas. Biasanya bakteri ini tumbuh pada makanan kaleng yang tidak sempurna pengolahannya atau pada kaleng yang bocor, sehingga makanan di dalamnya terkontaminasi udara dari luar. Botulinin merupakan sebuah molekul protein dengan daya keracunan yang sangat kuat. Satu mikrogram botulinin sudah cukup mematikan manusia. Untungnya karena merupakan protein, botulinin bersifat termolabil dan dapat diinaktifkan dengan pemanasan pada suhu 80 derajat Celsius selama 30 menit. Garam dengan konsentrasi 8 persen atau lebih serta pH 4,5 atau kurang dapat menghambat pertumbuhan C. botulinum, sehingga produksi botulinin dapat dicegah.

7. Pseudomonas cocovenenans

Senyawa beracun yang dapat diproduksi oleh Pseudomonas cocovenenans adalah toksoflavin dan asam bongkrek. Kedua senyawa beracun tersebut diproduksi di dalam tempe bongkrek, suatu tempe yang dibuat dengan bahan baku utama ampas kelapa. Asam bongkrek bersifat sangat fatal dan biasanya merupakan penyebab kematian. Hal ini disebabkan toksin mengganggu metabolisme glikogen dengan memobilisasi glikogen dari hati, sehingga terjadi hiperglikemia yang kemudian berubah menjadi hipoglikemia. Penderita hipoglikemia biasanya meninggal empat hari setelah mengonsumsi tempe bongkrek yang beracun.

Adapun perbedaan antara bakteri gram positif dengan gram negative adalah :

Sifat	Perbedaan relative
	Gram positif (+)	Gram negative (-)
Komposisi dinding sel	Kandungan lipid rendah	Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap  Penisilin	Lfebih sensitive	Lebih tahan
Penghambatan oleh  pewarna basa (VK)	Lebih dihambat	Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi	Kebanyakan spesies  relative kompleks	Relative sederhana
Ketahanan terhadap  perlakuan fisik	Lebih tahan	Kurang tahan

(Sumber : Sukarmina, Een. Debby M. Sumanti, In-in Hanida. 2008)

Isolasi kapang

Kapang merupakan kelompok fungi yang mempunyai filamen (miselium) dan pertumbuhannya pada makanan mudah dilihat karena penampakannya pada makanan yang berserabut seperti kapas , warnanya putih hingga berbagai warna (bila spora sudah tumbuh) tergantung spesies.

(Sumber : Untuk menumbuhkan kapang digunakan medium PDA (Potato Dextrose Agar), dimana spesifikasinya adalah untuk menumbuhkan kapang dan khamir. Sampel yang digunakan adalah sampel pengenceran terendah yaitu 10^-1. Metode yang digunakan adalah metode cawan gores dimana sampel diambil dengan menggunakan loop lalu digoreskan ke medium PDA yang telah membeku pada cawan petri. Sebelum diinkubasikan jangan lupa membungkus cawan petri lalu inkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu ruang yaitu 30-32⁰C selama 2 hari.

Setelah diinkubasikan selama 2 hari, ditemukan pertumbuhan kapang pada masing-masing sampel dengan rincian sebagai berikut:

§  Singkong        : 12 kapang

§  Sop                 : -

§  Kari ayam       : 16  kapang

§  Rendang(5)    : 175 kapang

§  Rendang(9)    : 1 kapang

Pengamatan pada kapang dilakukan dengan metode Moist Chamber. Caranya adalah pertama membersihkan gelas objek dengan kapas yang sudah diberi alcohol 70% kemudian dikeringkan. Tujuan daripada penggunaan alkohol adalah untuk meminimalisir mikroorganisme lain. Cawan petri dialasi kertas saring. Dalam cawan petri ini diletakkan gelas objek dan kaca penutup. Alat ini kemudian disteril. Kemudian meneteskan media agar PDA sebanyak 2 tetes yang agak melebar sehingga nanti dapat dipotong 1/3 bagiannya, dan didiamkan hingga membeku. Setelah agar membeku potong  1/3  bagian PDA tersebut dengan ose, sisihkan yang digunakan adalah 2/3 bagian. Ambil kapang yang telah dibiakkan satu ose untuk dilekatkan pada sisi PDA yang telah beku Mengoleskan vaselin pada 4 bagian sisi kaca penutup dengan bagian yang diberi vaselin tepat diatas agar yang telah ditanami, hal ini bertujuan untuk memberikan suasana aerob dan vaselin berguna untuk penyanggah kaca penutup agar tidak tertempel dengan media agat dan bakterinya. Untuk memnerikan suasan lembab, aquades steril diteteskan ke atas kertas saring yang ada didalam cawan petri tadi. Mikrokultur tadi dieramkan selama 2 hari pada suhu kamar karena kebanyakkan kapang bersifat mesofilik dan suhu optimum pertumbuhan untuk kebanyakan kapang adalah sekitar 25-30C. setelah diinkubasikan selama 2 hari didapat hasil :

warna spora                 : biru kehitaman

warna miselium           : biru kehitaman agak tipis

kesebaran spora           : menyebar dan saling berdimpitan

Kapang dapat menyebabkan kerusakan pada berbagai macam makanan dalam kondisi a_w, pH, dan suhu rendah. Jenis kapang yang dapat merusak makanan di antaranya Aspergillus, Penicillium, Botrytis, Alternaria, dan Mucor. Kerusakan sayuran kebanyakan disebabkan kapang seperti Alternaria, Botrytis, dan Phytophtora, atau bakteri yang berasal dari genus Erwinia. Senyawa beracun yang diproduksi oleh kapang disebut mikotoksin

Lebih dari 90 persen terjadinya foodborne diseases pada manusia disebabkan kontaminasi mikrobiologi, yaitu meliputi penyakit tifus, disentri bakteri atau amuba, botulism dan intoksikasi bakteri lainnya, serta hepatitis A dan trichinellosis. WHO mendefinisikan foodborne diseases sebagai penyakit yang umumnya bersifat infeksi atau racun yang masuk ke dalam tubuh melalui makanan yang dicerna. Keberadaan mikroorganisme dalam suatu bahan makanan disebabkan karena bahan makanan tersebut mengandung nutrient yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Kontaminasi mikroorganisme pada bahan makanan dapat menyebabkan penyakit, seperti tifus, kolera, disentri, atau tbc, yang mudah tersebar melalui bahan makanan. Gangguan-gangguan kesehatan, khususnya gangguan perut akibat makanan disebabkan, antara lain oleh kebanyakan makan, alergi, kekurangan zat gizi, keracunan langsung oleh bahan-bahan kimia, tanaman atau hewan beracun; toksin-toksin yang dihasilkan bakteri; mengkomsumsi pangan yang mengandung parasit-parasit hewan dan mikroorganisme. Gangguan-gangguan ini sering dikelompokkan menjadi satu karena memiliki gejala yang hampir sama atau sering tertukar dalam penentuan penyebabnya (Syarifah, 2002).

Pencegahan kontaminasi pangan seperti yang dianjurkan dalam Setyawan (2008) adalah sebagai berikut:

1.      Menyentuh makanan sedikit mungkin.

2.      Menghindarkan makanan dari semua sumber bakteri.

3.      Menutup makanan.

4.      Menghindarkan hewan dan serangga dari tempat makanan.

5.      Membuang sisa makanan dan sampah lain dengan hati-hati.

6.      Menjaga tempat sampah tetap tertutup.

7.      Menjaga segalanya sebersih mungkin

KESIMPULAN

§  Dalam pengolahan makanan tersebut, pengolah kurang menjaga kebersihan dan keamanan makanan sehingga ditemukan pertumbuhan mikroorganisme yang berlipat ganda.

§  Pada pengamatan moist chamber, sifat kapang yang dapat dilihat adalah miselium berwarna biru kehitaman, spora biru kehitaman, dan menyebar tapi saling berdimpitan.

DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi. Fateta IPB. Bogor.

Sukarmina, E., Debby M. Sumanti. In-in Hanidah. 2008. Mikrobiologi Pangan. Jurusan Teknologi Industri pangan. Fakultas Teknologi Industri Pertanian. Universitas Padjajaran. Jatinangor

Anonim.http://mawarmawar.wordpress.com/2009/03/03/mikroorganisme-dalam bahan-makanan/ diakses pada tanggal 23 april 2010 pukul : 10.04.

Astawan,M.http://cybermed.cbn.net.id/cbprtl/cybermed/detail.aspx?x=Nutrition&y=cybermed|0|0|6|425. diakses pada tanggal 23 April 2010 pukul : 10.05.